微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來(lái)，產(chǎn)率有了很大的提高，然而防止雜菌污染的要求也更高了。人們在與雜菌污染的斗爭中，積累總結出很多寶貴的經(jīng)驗。規范了管理措施，設計了一系列設備(例如密閉式發(fā)酵罐，培養基滅菌設備，無(wú)菌空氣制備設備等)和管道，應用了無(wú)菌室甚至無(wú)菌車(chē)間，建立了無(wú)菌操作技術(shù)，因而大大降低了發(fā)酵染菌率。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著(zhù)染菌的威脅，染菌后輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量，重者造成“倒罐” ，不但浪費大量原材料，造成嚴重的經(jīng)濟損失，還會(huì )對周?chē)h(huán)境造成破壞。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統稱(chēng)為雜菌污染，及早發(fā)現雜菌并采取相應措施，對減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要。 

 

因此檢查的方法要求準確、快速。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個(gè)時(shí)期。種子培養期染菌的危害大，因嚴格防止。一旦發(fā)現種子染菌，均應滅菌后棄去，并對種子罐及其管道進(jìn)行*滅菌。發(fā)酵前期養分豐富，容易染菌，此時(shí)養分消耗不多，應將發(fā)酵液補足必要養分后迅速滅菌，并重新接種發(fā)酵。發(fā)酵中期染菌不但嚴重干擾生產(chǎn)菌株的代謝，而且會(huì )影響產(chǎn)物的生成，甚至使已形成的產(chǎn)物分解。 

 

由于發(fā)酵中期養分已被大量消耗，代謝產(chǎn)物的生成又不是很多，挽救處理比較困難，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發(fā)酵后期染菌，此時(shí)產(chǎn)物積累已較多，糖等養分已接近耗盡，若染菌不嚴重，可繼續進(jìn)行發(fā)酵;若污染嚴重，可提錢(qián)放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，對發(fā)酵的影響就小。所以，實(shí)際生產(chǎn)中，應當根據污染程度和發(fā)酵時(shí)期區別對待。 

 

一、實(shí)驗器材與試劑 

 

1.器材 

 

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、帶搖床的培養箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養皿、 接種針、平板涂布器、酒精燈、載玻片 

 

2.試劑 

 

營(yíng)養瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、牛肉gao、蛋白胨、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液 

 

3.培養基 

 

(1)營(yíng)養瓊脂培養基：直接稱(chēng)量營(yíng)養瓊脂粉4.5g，溶于100mL蒸餾水配制，pH 7.2，分裝到試管中，滅菌后擺成斜面。 

 

(2)種子培養基：葡萄糖0.5%、磷酸二氫氨0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.1% 

 

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養基：牛肉gao0.3%、蛋白胨0.8%、葡萄糖 0.5%、氯化鈉0.5%、0.4% 酚紅溶液，pH 7.2 

 

二、實(shí)驗方法 

 

1.種子的擴大培養 

 

①斜面培養基的配制 配制營(yíng)養瓊脂培養基，分裝，滅菌(121℃條件下滅菌 30min)，倒斜面。 

 

②菌種的活化 

 

⑴將大腸桿菌采用無(wú)菌操作的方法接種于斜面上，37℃下培養18h; ⑵培養18h后，觀(guān)察菌落顏色是否一致，若均為黃色，挑取培養皿周邊的菌落進(jìn)行無(wú)菌檢測;若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進(jìn)行無(wú)菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢，若檢測后，沒(méi)有污染，便可進(jìn)行擴大培養;若檢測到雜菌，要重復上述步驟，直到無(wú)菌為止，否則，不能繼續下一步操作。 

 

③擴大培養 在無(wú)菌條件下，從檢測后的活化培養基上挑取10個(gè)左右菌落，用接種針接種到擴大培養基(即種子培養基)中，于37℃下振蕩培16-18h，觀(guān)察菌落形態(tài)。然后配合顯微鏡形態(tài)觀(guān)察，根據結果來(lái)判斷能否進(jìn)行下一步。 

 

2.污染的檢測和判別 

 

①顯微鏡檢查 

 

⑴取樣：用無(wú)菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上; 

 

⑵制片、染色：自然風(fēng)干后,用番紅染液染色1-2min，水洗; 

 

⑶干燥后用油鏡下觀(guān)察。 

 

②平板檢查

 

 ⑴配制營(yíng)養瓊脂培養基，滅菌，倒平板;

 

 ⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約10–6-10–7) 后涂布在營(yíng)養瓊脂平板上，在37℃下培養24h;

 

 ⑶觀(guān)察菌落形態(tài)。 

 

③肉湯培養檢查法(用于檢測培養基滅菌是否*) 將1ml待測液(滅菌處理后的種子培養基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養基中，于37℃下培養24h，觀(guān)察培養基的狀態(tài)和顏色。

 

 三、實(shí)驗結果 

 

1.種子的擴大培養 

 

觀(guān)察到在活化培養基上長(cháng)出大量菌落，且菌落顏色單一，均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量，制作裝片，染色后在顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現多個(gè)視野中都為桿菌，可初步得出活化的菌種中沒(méi)有污染雜菌。挑取沒(méi)有污染雜菌的菌落，用無(wú)菌操作技術(shù)接種，進(jìn)行擴大培養。在適宜條件下培養18h后，得到了大腸桿菌的種子液，吸取該種子液在顯微鏡下觀(guān)察到有大量的大腸桿菌。 

 

2.顯微鏡檢查 

 

鏡檢時(shí)，多個(gè)視野中均觀(guān)察到的均為桿菌，呈鏈狀或單個(gè)存在，沒(méi)有觀(guān)察到球菌或其它形態(tài)的的細菌，因此可初步認為該種子液中沒(méi)有雜菌污染。 

 

3.平板檢查 

 

從營(yíng)養瓊脂平板培養基上觀(guān)察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，這是典型的大腸桿菌菌落，沒(méi)有觀(guān)察到其它形態(tài)的菌落，因此可初步認為該種子液中沒(méi)有雜菌污染。 

 

4.肉湯檢測培養基滅菌是否* 

 

葡萄糖酚紅肉湯培養基中有酚紅染液，酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境中呈紅色。肉湯培養基中接種的待測液若有菌體存在，則菌體代謝會(huì )使培養基呈酸性，顯示黃色。該肉湯培養基經(jīng)培養后，仍呈現紅色，沒(méi)有變?yōu)辄S色，且澄清，未渾濁，說(shuō)明待測液中沒(méi)有菌體存在，，因此，所測的滅菌種子培養基中沒(méi)有被菌體污染。 

 

四、實(shí)驗討論 

 

1.在種子的擴大培養前要對菌種進(jìn)行活化培養以獲得有活性的種子，若菌種已活化則可省略這一步。種子擴大培養時(shí)，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌，則應棄去或用平板培養基純化后再用來(lái)活化和擴大培養。 

 

2.采用顯微鏡檢查法，如果從視野中發(fā)現有與目標菌株不同形態(tài)的菌體則可認為是污染了雜菌，該法簡(jiǎn)便、快速，能及時(shí)檢查出雜菌。

 

但是也有其不足之處：

 

①對含雜菌少的樣品不易得出正確的結論，故應多檢查幾個(gè)視野;

 

②由于菌體較小，本身又處于非同步狀態(tài)，應注意不同生理狀態(tài)下目標菌與雜菌的區別，必要時(shí)可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對固形物多的發(fā)酵液檢查較困難。 

 

3.采用平板檢查法，若出現與目標菌株形態(tài)不一的菌落，就表明可能被雜菌污染;若要進(jìn)一步確證，可配合顯微鏡形態(tài)觀(guān)察，若個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標菌相異，則可確認污染了雜菌。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測，形象直觀(guān)，肉眼可辨，不需儀器。但需嚴格執行無(wú)菌操作技術(shù)，所需時(shí)間較長(cháng)，而且無(wú)法區分形態(tài)與目標菌相似的雜菌。在污染初期，目標菌占絕大部分，污染菌數量很少，所以要做比較多的平行試驗才能檢出污染菌。 

 

4.肉湯培養檢查法只能用來(lái)檢測培養基的滅菌是否*，不適用于發(fā)酵液的檢查。 

 

5.可以用發(fā)酵參數判斷法來(lái)檢測是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過(guò)程中，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標，作曲線(xiàn)，若在工藝不變的情況下這些特征性曲線(xiàn)發(fā)生變化，則很可能是污染了雜菌。但是，發(fā)酵參數判斷法很難檢查出早期的污染菌。 

 

五、結論 

 

了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害，知道染菌不僅浪費大量原材料，造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且污染了環(huán)境，所以，在種子活化培養和擴大培養中每一步均需進(jìn)行無(wú)雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來(lái)檢測雜菌污染，方法較為簡(jiǎn)便、形象直觀(guān)，但是，若要進(jìn)行更準確的檢測，zuihao再做較多的平行實(shí)驗。肉湯培養檢查法是用于檢測培養基滅菌是否*的有效方法。